[일반화학실험] 8. 크로마토그래피 레포트

1. 목적 

정상과 역상 크로마토그래피법으로 색소를 분리함으로써 크로마토그래피의 원리와 극성의 개념을 배운다.

 

2. 시약, 기구

• 기구 : 500mL 비커, 시계 접시, 모세관, TLC판 / C-18 카트리지 / 10mL 주사기, 거름 종이, 가는 유리봉, 솜
• 시약 : 적색 40호, 황색 5호, 청색 1호 식용 색소, 전개제, 1-부탄올:아세트산:물의 비가 60:15:25인 혼합용액 / 적색 40호, 황색 5 또는 6호, 청색 1호의 묽은 혼합 용액, 청색 1호의 아주 묽은 용액 / 알루미나, 전개제, 1-부탄올과 암모니아수를 6:2로 혼합한 용액

 

3. 원리

(1) 크로마토그래피 종류

• 흡착 크로마토그래피 : 화합물이 고체 표면에 흡착되는 정도의 차이를 이용
• 젤 투과 크로마토그래피 : 작은 분자가 교대로 결합된 겔의 틈새를 잘 침투하는 효과를 이용
• 이온교환 크로마토그래피 : 주어진 pH에서 화합물이 해리해서 생긴 이온의 전하 차이를 이용
• 분배 크로마토그래피 : 용매에 녹는 정도가 다른 점을 이용

 

(2) 분배 크로마토그래피 : 물질마다 용매에 대한 분배계수가 다른 점을 이용하는 크로마토그래피

① 액체-액체 분배 크로마토그래피 : 고체 표면에 얇은 액체의 막을 입힌 정지상 사이로 극성이 다른 용액(이동상)을 흘려주면서 두 액체 사이에 물질의 분배가 일어나도록 하는 경우

②기체-액체 분배 크로마토그래피 : 기체를 이동상으로 하는 경우

• 이동상 : 전개제라고 부르며, 뷰탄올, 아세트산, 암모니아처럼 물보다 극성이 작은 화합물의 혼합 용액
• 모세관 현상으로 전개제가 TLC판 위쪽으로 전개될 때 시료 분자들도 함께 퍼지게 되는데, 시료 분자들이 정지상에서 노출된 실리카젤의 실란올기와 이동상 사이에 분배되는 계수가 다르기 때문에 전개제가 위쪽으로 올라가면서 시료 분자들이 분리됨 

③정상 액체 크로마토그래피 : 실리카젤이나 알루미나 같이 극성이 큰 고체 표면에 물 같이 극성이 큰 액체 막을 입힌 정지상과 극성이 작은 용액을 이동상으로 사용

④역상 액체 크로마토그래피

• 옥타데실기처럼 긴 탄화수소 사슬이 공유결합으로 결합된 막을 입힌 작은 입자를 정지상으로 사용
• 탄소와 수소는 전기음성도의 차이가 작기 때문에 C-H 결합은 무극성이고, 37개의 C-H 결합을 가진 C-18기가 결합된 막을 가진 정지상은 극성이 대단히 낮은 분자 단위의 액체막
• 물과 유기용매를 섞어서 극성을 조절한 혼합용액을 이동상으로 사용
  → 극성이 다른 색소의 혼합물을 C-18 카트리지에 통과시키면 극성이 작은 색소는 C-18기와 친화적 상호작용을 하기 때문에 정지상에 오래 머물게 되고, 물과 상호작용을 더 잘하는 극성이 큰 화합물은 물을 따라 먼저 흘러나오게 된다.

→ 화합물과 사용하는 전개제의 종류에 따라 독특한 값을 나타냄

 

4. 유의사항

칼럼을 충전할 때 기포가 없이 골고루 충전하는 것이 중요하다. 연필과 같은 것으로 주사기 몸통을 톡톡 치면서 충전제를 천천히 넣으면 골고루 충전할 수 있다.

 

5. 실험과정

실험 A. 얇은층 크로마토그래피에 의한 색소의 분리(정상 크로마토그래피)

출처: 표준일반화학실험

1. 적색 40호, 황색 5호, 청색 1호의 묽은 혼합 용액 각각과 4가지의 미지 시료를 모세관에 묻혀서 TLC판의 바닥으로부터 1cm 높이의 위치에 1cm 간격으로 일렬로 찍어서 반점을 만들고 말린다.
2. TLC판을 1-부탄올:아세트산:물을 60:15:25의 비로 혼합한 전개제가 담긴 비커에 넣어서 전개를 시작한다. 그림 8-3과 같이 시료의 반점이 전개제에 잠기지 않도록 TLC판을 수직으로 세우고, 시계 접시를 덮어서 전개제가 증발하지 않도록 한다.
3. 전개제가 TLC판의 위쪽 끝에서 1cm 정도 떨어진 곳까지 도달하면 TLC판을 꺼내서 말린 다음에 그림 8-4와 같이 Rf값을 측정한다. 순수한 색소의 Rf값과 미지 시료의 경우에 생긴 반점들의 Rf값을 비교해서 미지 시료에 들어있는 색소의 종류를 알아낸다.

 

실험 B. C-18 카트리지를 이용한 색소의 분리(역상 크로마토그래피)

1. C-18 카트리지를 주사기에 끼우고 노랑, 빨강, 파랑 색소의 혼합 용액 한 방울을 카트리지 위쪽에 넣은 후 약 3mL의 물을 주사기에 채우고 서서히 약한 압력을 가한다. 세 가지 색소가 분리되는 것을 관찰하고 이들 색소를 극성이 큰 것부터 작은 것 순서로 나열한다.
2. 주사기 위쪽에 남아있는 물을 버리고, 30% 메탄올 3mL 정도를 채운 후에 압력을 가하여 흘려주면서 카트리지에 남아있는 색소가 어떻게 움직이는가를 관찰한다. 카트리지를 사용한 후에는 100% 메탄올 3mL로 카트리지를 씻어내고, 3mL의 물로 다시 씻어낸 후에 다시 사용한다.
3. 파랑 색소의 묽은 용액 5mL 정도를 세척한 카트리지에 통과시키면서 색소가 어떻게 되는지, 그리고 나오는 용액의 색깔은 어떻게 바뀌는지 관찰한다.

 

실험 C. 칼럼 크로마토그래피를 이용한 색소의 분리(정상 크로마토그래피)

출처: 표준일반화학실험

1. 그림 8-5와 같이 10mL 주사기를 수직으로 세우고, 긴 유리봉을 이용하여 유리솜으로 아래를 막아 충진제가 빠지지 않도록 한다.
2. 1-부탄올과 암모니아수(2M)를 6:2으로 잘 섞어서 분액 깔때기에 넣고 5분간 잘 흔들어 섞은 후 두 층으로 갈라지게 두었다가 위층의 용액을 용리액으로 사용한다.
3. 용리액을 주사기에 약 3/4정도 채우고 여기에 알루미나를 채운다. 이때 알루미나가 골고루 채워지도록 하기 위해 연필로 주사기를 가볍게 톡톡 치면서 전체 부피의 약 3/4정도 되도록 채운다.
4. 거름 종이를 주사기 안쪽 지름에 맞도록 원형으로 잘라 맨 위에 깐다(이때, 항상 고체의 윗 부분까지 용리액이 채워져 있어야 한다).
5. 색소 혼합 용액 두세 방울을 조심스럽게 거름종이 위에 가한다.
6. 용리액을 서서히 흘려주면서 색소가 분리되는 것을 관찰한다.

 

6. 실험결과

실험 A. 얇은층 크로마토그래피(TLC)에 의한 색소의 분리

1. 관찰된 Rf값을 적어라

	적색 40호	황색 5호	청색 1호	미지 시료 A	미지 시료 B	미지 시료 C	미지 시료 D
Rf	0.55	0.21	0.25

 

2. 전개제의 증발을 막아야 하는 이유를 설명하여라.
혼합 용매로 전개액을 사용할 때 각각의 용매는 증발 정도가 다르다. 따라서 용매가 증발되면 전개액의 조성이 바뀌어 전개 속도가 일정하지 않게 되고 용매와 시료의 이동거리에 영향을 주기 때문에 용매가 증발하지 않도록 전개제의 증발을 막아야 한다.


3. 혼합물 중에서 한 가지 성분이 값비싼 의약품이고 나머지는 부작용을 일으키는 불순물일 경우에 TLC를 사용해서 원하는 성분만을 순수한 고체 상태로 얻으려면 어떻게 하면 될까?
의약품으로 사용가능한 물질이 묻어있는 부분의 실리카겔을 긁은 후 유기용매에 녹인다. 그 후 여과 장치로 실리카겔을 제거하고, 감압여과장치로 유기용매를 날리는 과정과 재결정을 반복해 순수한 고체 상태의 의약품을 얻는다.

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4. 이 실험에서는 TLC를 이용해서 혼합물을 구성하는 화합물의 종류를 확인하였다. 만약 혼합물에 섞여있는 화합물의 농도도 함께 알고 싶을 경우에는 어떤 방법이 가능하겠는가?
흡광도를 측정한 후 Beer 법칙으로 계산한다. 혼합물의 흡광도를 다른 파장에서 두 번씩 측정한 후 연립방정식으로 풀면 된다.




실험 B. C-18 카트리지를 이용한 색소의 분리

1.

• 나오는 순서 : 황색, 청색, 적색
• 극성의 크기 : 황색>청색>적색

 

2. 카트리지에 결합된 색소를 흘러나오게 하려면 이동상의 극성을 (크게, 작게) 해주어야 한다. 물 분자의 수소 하나가 메틸기로 치환된 메탄올은 물보다 극성이 (크다, 작다).

 

3. 실험 과정 2에서 30% 메탄올을 사용했을 때의 관찰 결과를 설명하여라.
물보다 극성이 작으므로 용리 시간이 길어진다.

4. 위의 실험 과정 3의 관찰 결과를 설명하여라.
C-18은 정지상이 비극성이므로 역상크로마토그래피이다. 따라서 극성이 큰 물질먼저 용리된다.

5. 전체적으로는 극성의 차이가 거의 없지만 극성이 작은 부위에 약간의 차이가 있는 경우에는 정상 크로마토그래피와 역상 크로마토그래피 중에서 어느 쪽이 분리에 유리할까? 그 이유를 설명하여라.

역상 크로마토그래피, 극성이 작은 정지상에서의 분리가 더 잘 일어나기 때문

 

6. 지금까지 알려진 화합물의 종류는 2천만 가지에 이르고, 그 중 70% 이상은 유기화합물이다. 대부분의 유기화합물의 분리에는 정상 크로마토그래피와 역상 크로마토그래피 중에서 어느 쪽이 더 유용할까? 그 이유를 설명하여라.

역상크로마토그래피, 유기화합물은 탄화수소에 극성인 작용기가 붙어 있는 구조이다. 이때 탄화수소는 비극성이고 작용기는 극성이므로, 차이를 분석하기 위해서는 정지상이 비극성이고 이동상이 극성인 역상크로마토그래피를 이용해 용리순서를 비교해야한다.


7. 사용하는 이동상의 경제성, 환경 친화도 등을 고려하면 정상 크로마토그래피와 역상 크로마토그래피 중에서 어느 쪽이 더 유리할까? 그 이유를 설명하여라.

역상 크로마토그래피, 전개제가 극성일 때 물에 잘 용해되며 그 종류도 많기 때문이다.

 

8. 우리에게 환경 문제의 심각성을 깨우쳐준 저서 “조용한 봄”에서 카슨은 유기 농약과 같은 환경오염 물질이 지방질의 세포 조직에 농축되는 문제를 언급하고 있다. 실험 과정 3의 관찰 결과로부터 식품을 통해 섭취하는 소량의 유기 농약이 장기적으로는 문제가 될 수 있는 이유를 설명하고, “묽히는 것이 오염 문제의 해결책”이라는 생각이 이 환경 오염 문제에 대한 해결책이 되는 경우와 아닌 경우의 예를 들어 보아라.

우리 몸을 구성하고 있는 성분 중 대부분은 물로 이뤄져있다. 물은 극성이기 때문에 극성을 띠는 물질을 잘 용해한다. 하지만 식품을 통해 섭취하는 유기 농약은 유기물질로 물과 잘 섞이지 않는다. 따라서 물과 섞여 오줌을 통해 우리 몸으로 배설될 수 없어 우리 몸에 계속해서 축적되기 때문에 장기적으로 문제가 될 수 있다. 묽히는 것이 오염 문제의 해결책이라는 문장에 대해서는 극성을 띠는 물질은 묽히기가 가능하지만, 비극성을 띠는 물질은 물과 섞이지 않으므로 해결책이 되는 경우는 용질이 극성인 경우, 해결책이 되지 않는 경우는 용질이 비극성인 경우이다.

실험 C. 칼럼 크로마토그래피를 이용한 색소의 분리(실험못함)

1. 나오는 순서 :
극성의 크기 :

2. 실험 C의 과정 ⑥에서 관찰한 것을 실험 B의 결과와 비교해 설명하여라.

3. 칼럼 크로마토그래피는 혼합물로부터 순수한 물질을 분리하는 데 자주 사용하는 방법이다. 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 혼합 용액의 색소들 중 순수한 파란색 색소를 분리하여 얻고자 한다면, 실험 C에 어떤 과정이 추가되어야 하는지에 대해 설명하여라.